Un equipo de científicas y científicos del CONICET en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR, CONICET-UNR), junto con colegas de Alemania, presentaron recientemente un nuevo biosensor que tiene la capacidad de detectar la energía disponible en células de bacterias, plantas y animales, al que llamaron NERNST.
“Es una nueva herramienta y un compromiso con la comunidad científica de que sea libre y con acceso para todos”, afirma Néstor Carrillo, investigador del consejo y líder del proyecto de investigación. Este nuevo biosensor genéticamente codificado permite monitorear in vivo el equilibrio dinámico del estado de óxido-reducción en las células, un elemento clave del metabolismo de todos los seres vivos. Su diseño y caracterización fue publicado en la revista Nature Communications y genera mucha expectativa porque “abre un universo de nuevas preguntas que pueden hacerse y eventualmente responderse en el campo de la investigación biológica”, resalta Carrillo, y confiesa: “Nos propusimos hacerlo porque nos hacía falta para nuestras propias investigaciones, pero nunca tuvimos dudas que, si teníamos éxito, esto iba a servir para muchas aplicaciones que de momento ni siquiera se podían plantear porque no existía posibilidad de abordarlas”.
Si te oxido, me reduzco: la bioquímica redox de la vida
Resulta evidente asociar el término oxidación al deterioro de los metales como el hierro, sin embargo, a nivel químico este concepto es más amplio. Se dice que un elemento se oxida cuando pierde electrones, y en contrapartida, que cuando los gana, se reduce. En el caso del óxido esto es justamente lo que sucede, hay una transferencia de electrones desde el hierro hacia el oxígeno, donde el metal se oxida y el oxígeno se reduce.
En los seres vivos los procesos de oxidación-reducción (redox) son fundamentales e involucran cientos de reacciones donde hay transferencia de electrones entre moléculas muy diversas. Fenómenos biológicos tan distintos como la inflamación o la fotosíntesis se valen de estas reacciones porque “la bioquímica redox está en el origen de la vida”, afirma Carrillo, y explica: “Es una bioquímica de red, donde el producto de una reacción reducida, reduce a otra y se forman nodos que se conectan entre sí a través de intermediarios”.
NERNST (sigla derivada de su denominación en inglés que significa: Herramienta Sensora Ratiométrica y no Destructiva para Estimar NADPH) fue diseñado para sensar específicamente el estado de oxidación o reducción de uno de estos intermediarios, una molécula llamada NADP+, que, como indica Carrillo, “es la divisa universal de cambio de la bioquímica redox en todos los organismos vivos”. El balance entre la forma reducida (NADPH) u oxidada (NADP+) de esta molécula define el equilibrio dinámico del estado de óxido-reducción en una célula, por ello NERNST constituye una poderosa herramienta para estudiar los procesos redox fundamentales de los seres vivientes.
Si me reduzco, te ilumino: la bioquímica detrás de NERNST
La estructura básica de un biosensor tiene un módulo receptor, que interactúa específicamente con el compuesto de interés, y un módulo de salida o “output”, que transforma la señal que detecta el receptor en una señal que se puede medir.
A la hora de diseñar NERNST, el grupo de investigación ya contaba con un buen candidato para output, una proteína llamada roGFP, que, dependiendo de su estado de reducción u oxidación, cambia sus propiedades ópticas y emite fluorescencia de color verde. Esta señal puede medirse con muchos métodos y en los más diversos organismos. Ahora, para el módulo receptor debían encontrar una enzima que, tomando los electrones del NADPH, afectara el estado redox de roGFP y para elegirla usaron la amplia experiencia que tenían en el grupo sobre los transportadores de electrones.
Luego del minucioso diseño siguió la etapa de materialización: “Era fundamental que el sensor fuese una construcción diseñada genéticamente para que cada organismo que lo lleva en sus células lo pueda sintetizar de manera estable”, explica Adriana Krapp, doctora en bioquímica y personal de apoyo del CONICET, que trabaja junto a Carrillo desde 1989. “Comenzamos el desarrollo en el año 2015 y eventualmente logramos una construcción donde unimos una enzima específica para NADP(H) –llamada tiorredoxina reductasa C – con roGFP”, detalla.
Entonces, sólo faltaba ponerlo a prueba. Por un lado, introdujeron la construcción genética en distintos sistemas biológicos, desde bacterias hasta peces, pasando por plantas y cultivos de células humanas, comprobando que todos ellos podían expresar y fabricar NERNST.
Además, hicieron múltiples pruebas de concepto, donde sometieron a estos organismos a condiciones experimentales de las cuales ya existe un conocimiento consolidado sobre el efecto que tienen en su estado redox. Midiendo la fluorescencia emitida verificaron que, en todos los casos, el sensor respondía en tiempo y espacio según lo esperado. “En base a la relación de fluorescencia que obtenemos en la cuantificación podemos determinar cuán oxidado o reducido está el sensor. Con ese dato, podemos calcular el potencial redox del pool de NADP+/NADPH y determinar si ese organismo está en un camino oxidativo o reductor. Esto nos permite hacer predicciones sobre como lo afectará una determinada condición biológica”, amplia Carrillo.
Según Adriana Krapp, ya son varios los grupos de investigación que han solicitado el material para probar NERNST en sus laboratorios: “Ahora tiene que resistir la prueba del tiempo y el uso, cuantos más grupos e investigadores lo usen más se va a fortalecer”.
NERNST: un pie de página
La culminación de este trabajo llega en un momento muy especial de la carrera de Carrillo y Krapp, ambos con una vida dedicada a la investigación científica en Argentina. “Este trabajo es un poco una síntesis de nuestra carrera. De alguna manera es como un pie de página de algo que comenzó 30 años atrás durante mi doctorado, de los trabajos con que iniciamos este grupo de investigación”, reflexiona Carrillo. Por su parte, Krapp añade que “siempre hay que volver a las fuentes” y resalta que mientras el trabajo cierra su carrera con una gran satisfacción, es al mismo tiempo el comienzo de otra, la de Pamela Molinari, que con este trabajo realizó su tesis doctoral en IBR siendo becaria del CONICET.
En retrospectiva a tantas investigaciones y proyectos realizados, Carrillo señala: “Todas las cosas en que me he involucrado me han parecido fascinantes, uno siempre trata de contextualizar lo que hace, haciéndolo interesante para otros. Pero por ser investigadores básicos, la curiosidad juega un rol muy importante, encontrarnos con algo que no está resuelto, nos resulta intolerable, aunque sea también un desafío resolverlo”. La propia historia de NERNST es un ejemplo de esto. “Tuvimos la idea mucho tiempo en mente, pensando qué pena que no existía una herramienta así. Haberlo conseguido es una gran satisfacción en ese sentido”, expresa con orgullo Carrillo, y agrega con cierta picardía: “¡Ojalá tuviera 20 años menos para poder usarlo en todos los experimentos!”
Referencias bibliográficas:
Pamela E. Molinari, Adriana R. Krapp, Andrea Weiner, Hannes M. Beyer, Arun Kumar Kondadi, Tim Blomeier, Melina López, Pilar Bustos-Sanmamed, Evelyn Tevere, Wilfried Weber, Andreas S. Reichert, Nora B. Calcaterra, Mathias Beller, Néstor Carrillo & Matias D. Zurbriggen. NERNST: a genetically-encoded ratiometric non-destructive sensing tool to estimate NADP(H) redox status in bacterial, plant and animal systems. 2023. Nature Communications.
Por Elizabeth Karayekov – Comunicación IBR (CONICET-UNR)
Fuente: CONICET Rosario